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Memantine Upregulates BDNF und verhindert Dopamin-Defizite bei SIV-infizierten Makaken: Eine neuartige pharmakologische Wirkung von MemantineTop von pageAbstractN Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptor-Aktivierung ist in die pathogenetischen Kaskaden neurodegenerativer Erkrankungen einschließlich humaner Immundefektviren (HIV) Demenz involviert. Memantine, ein unkompetitiver NMDA-Rezeptor-Antagonist, der vor kurzem für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit genehmigt wurde, wird als potenzielle adjunktive therapeutische Substanz für die HIV-Demenz diskutiert. Zur Untersuchung der Wirkung von Memantin wurden Simian-Immundefizienz-Virus-infizierte Rhesus-Makaken verwendet Hirn-Dysfunktion und Gehirn-Pathologie innerhalb von 3 Monaten nach anfänglicher Infektion im frühen asymptomatischen Stadium der Erkrankung.Wir hatten zuvor gezeigt, dass innerhalb dieses Zeitrahmens deutliche Veränderungen in den dopaminergen Systemen deutlich wurden.Medantin wurde zwei Wochen nach der Infektion in der Peakvirämie, Um eine frühe NMDA-Rezeptor-Aktivierung durch Immunmediatoren zu verhindern.Wir haben festgestellt, dass Memantin den Beginn von Dopamin-Defiziten im Gehirn von SIV-infizierten Makaken verhindert, ohne die frühe Gehirn-Pathologie oder den peripheren Verlauf der Infektion zu beeinflussen.Memantin spezifisch hochregulierte mRNA und Proteinexpression der neurotrophischen Faktor Hirn-abgeleiteten neurotrophischen Faktor (BDNF), was darauf hindeutet, dass die schützende Wirkung von Memantin auf Dopamin-Funktion mechanistisch entfernt von NMDA-Rezeptor-Antagonismus sein kann. Diese neue pharmakologische Wirkung von Memantin kann auch für andere neurodegenerative Störungen relevant sein und unterstützt die Beteiligung von neurotrophischen Faktoren beim adulten Gehirnneuroprotektion.

Schlüsselwörter: Memantine, Dopamin, BDNF, Demenz, HIV, SIV

Seitenanfang Seitenanfang EINFÜHRUNG Die Infektion des zentralen Nervensystems (ZNS) durch das humane Immunschwächevirus (HIV) Typ 1 führt zu neuropsychiatrischen Erkrankungen, die gemeinsam als HIV-Demenz bekannt sind. Obwohl die hochwirksame antiretrovirale Therapie sowohl die Inzidenz als auch die Schwere der HIV-Demenz verringerte (McArthur, 2004), stieg die Prävalenz mit einer längeren Lebensdauer der Patienten an und die neuropsychologische Funktion verbesserte sich nicht bei allen behandelten Patienten (Cysique et al.

Es wird derzeit angenommen, dass Makrophagen eine wichtige Rolle bei der HIV-Neurotoxizität durch die Produktion von viralen Neurotoxinen und Immunaktivierungen mit anschließender Freisetzung von neurotoxischen Faktoren spielen, die an den N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptoren wirken (Kaul et al., 2001). Die meisten der Hinweise, dass Neurone aufgrund von Überaktivierung von NMDA-Rezeptoren bei HIV-Demenz sterben können, stammen aus In-vitro-Studien über neurotoxische Wirkungen von HIV-Proteinen (Mattson et al., 2005) und indirekt aus Beobachtungen erhöhter Produkte mit NMDA-agonistischem Potenzial in CSF Von HIV-infizierten Patienten (Heyes et al., 2001) und SIV-infizierten Rhesus-Makaken (Koutsilieri et al., 1999). Darüber hinaus ist Glutamat im Gehirn von asymptomatischen SIV-infizierten Tieren vermehrt, ohne von einer neuronalen Dysfunktion begleitet zu werden (Bossuet et al., 2004). Dies deutet auf intakte Kompensationsmechanismen hin, die die glutamatinduzierten neurotoxischen Kaskaden im asymptomatischen Stadium der Erkrankung einschränken. Jedoch können die kombinierten Mechanismen erhöhter Pools von Glutamat mit Dysregulation der NMDA-Rezeptorfunktion durch Immunaktivierung zu einer neuronalen Calciumüberladung und zellulärer Dysfunktion und zum Tod führen (Mattson et al., 2005). Es ist daher entscheidend, neurochemische Veränderungen zu stoppen, bevor die Ansammlung toxischer Produkte und Entzündungen weit verbreitet ist, nämlich in einer frühen asymptomatischen Phase der Infektion.

Der NMDA-Antagonist Memantine ist ein nicht-kompetitiver NMDA-Rezeptor-Antagonist mit verbesserter Spannungsabhängigkeit, Kinetik und Affinität im Vergleich zu endogenem Mg2 (Danysz und Parsons, 2003) und wird derzeit zur Behandlung von senilen Demenzen verwendet. Memantine wurde in einer placebokontrollierten Studie zur Behandlung von sensorischer Neuropathie, die mit HIV assoziiert ist, ohne günstige Ergebnisse untersucht (Schifitto et al.,endless love armband replik, 2006). Es wurde jedoch gezeigt, dass Memantin schützende Effekte auf Zelltoxizität und synaptische Funktionen ausübt. Memantine hemmt die HIV-gp120-evozierten Kalziumveränderungen in Neuronen und Astrozyten und schützt Neurone von gp120-induziertem Zelltod (Lipton, 1992; Nath et al., 2000). Darüber hinaus ist Memantin in transgenen Mäusen vorteilhaft, die gp120 konstitutiv exprimieren (Toggas et al., 1996), und es verbessert die synaptische Funktion bei muriner HIV-Enzephalitis (Anderson et al., 2004), was darauf hinweist, dass diese Substanz ein guter Kandidat für eine adjunktive Therapie für HIV sein kann Infizierten Menschen.

Bei den frühen Infektionen fanden wir in den dopaminergen Systemen im Gehirn von SIV-infizierten Rhesusmakaken eine weitgehende Beeinträchtigung (Jenuwein et al., 2004, Scheller et al., 2005). In dieser Studie vermuteten wir, dass frühe Dopamindefizite im Gehirn von SIV-infizierten Makaken möglicherweise auf die NMDA-Rezeptor-Aktivierung durch Entzündungen zurückzuführen sind, die durch Invasion von Virus- und Immunzellen im Gehirn während der anfänglichen Spitzenhirnvirämie induziert wurden, und wir behandelten Affen an der Spitze viremia zwei Wochen nach Infektion mit dem NMDA-Antagonisten Memantine. Unser zentrales Ziel war es, das Schutzpotential von Memantin auf die beobachtete frühe Hirnfunktionsstörung zu untersuchen.

SeitenanfangMethodenJuvenile Rhesusaffen (Macaca mulatta) chinesischen Ursprungs wurden einzeln in Innenräumen auf einem 12-fachen Zeitplan im Deutschen Primatenzentrum (G Deutschland) untergebracht. Trockene Nahrung mit frischen Früchten (Bananen und Äpfel) als Nahrungsergänzungsmittel wurde zweimal täglich zur Verfügung gestellt und Wasser zur Verfügung ad lib. Vor der Impfung wurden Tiere als Seronegativ für STLV 1, SRV 1 (Typ D-Retrovirus), Herpes B-Virus und SIV nachgewiesen. Die Behandlung begann 2 Wochen nach der Infektion (wpi) und gleichzeitig mit Peak-Viremie. Alle infizierten Tiere wurden zu bestimmten Zeitpunkten ohne Anzeichen von simian AIDS getötet. Vier nichtinfizierte Tiere dienten als Kontrollen. Tiere wurden klinisch überwacht und Blutproben wurden in regelmäßigen Abständen unter Ketaminanästhesie von erfahrenen Tierärzten im Deutschen Primatenzentrum durchgeführt. Affen wurden während der ersten 5 Monate der Infektion getötet, um frühe Auswirkungen der SIV-Infektion auf das ZNS zu untersuchen. Anästhesierte Tiere wurden durch Exsanguination zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer Infektion im Bereich von 11,9 Wpi getötet. Die Gehirne wurden sorgfältig mit 2 von RPMI 1640-Medium (Gibco, Eggenstein, Deutschland), das 3 fötales Kälberserum enthielt, perfundiert. Die Gehirne wurden schnell entfernt, teilweise immersionsfest (5 neutraler gepufferter Formaldehyd für die Lichtmikroskopie) und teilweise für die biochemische Analyse eingefroren. Vor neurochemischen Untersuchungen wurde putamen auf einer Teflonplatte nach einem stereotaktischen Atlas unter Verwendung standardisierter Verfahren seziert.

BDNF-GenexpressionTotale RNA wurde unter Verwendung des RNeasy-Midi-Kits (Qiagen GmbH,cartier armband schraube replika, Hilden, Deutschland) aus Putamen von Rhesus-Macaques extrahiert. Die Proben wurden spektrophotometrisch von 220 bis 320 gescannt, wobei die A260 der Gesamt-RNA typischerweise auf RNAStdsenseChip unter Verwendung der Experion-Elektrophorese (BioRad, Deutschland) getestet wurde. Für alle extrahierten Gesamt-RNAs wurden die 28S-Verhältnisse Gesamt-RNAs der DNase-I-Verdauung (Qiagen GmbH) unterworfen, um genomische DNA-Reste zu entfernen und anschließend mit dem RNeasy-Midi-Kit (Qiagen GmbH) zu reinigen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen der spektralen Reinheit, der Abbaugeschwindigkeit, der Molekulargröße, der Ausbeute oder dem Gewebe-pH-Wert zwischen den Gruppen festgestellt.

Gene-Chip-Arrays Zur Vorbereitung der markierten cRNA wurden die im Affymetrix-Gen-Chip-Expressionsanalyse-Handbuch (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA) im Detail beschriebenen Verfahren verfolgt. Die Bestätigung der Gesamt-RNA-Qualität wurde durch Hybridisierung eines kleinen Teils des markierten cRNA-Targets an Affymetrix Test3 Array (Affymetrix 900341) durchgeführt. Markiertes cRNA wurde an GeneChip Rhesus Macaque Genom Array (Affymetrix 900656) in einer Affymetrix Fluidics Station 400 hybridisiert. Louis, MO, USA). Die Arrays wurden dann erneut mit Streptavidin-R-Phycoerythrin gefärbt und unter Verwendung eines GeneChip-Scanners 3000 gescannt. Der verwendete Gen-Chip enthielt mehrere Sondensätze,armband cartier replika, die für das Rhesus-Makakenhaus spezifisch waren und Gene wie den Dehnungsfaktor 1 und GAPDH, die als Positivkontrollen dienten, enthalten. Mehrere Mäuse- und Hefesonden-Sets auf jedem Chip dienten als Negativkontrollen, und extern dotierte bakterielle bioB, bioC, bioD und cre dienten als positive Hybridisierungskontrollen. Die resultierenden Signalintensitäten wurden durch Varianzstabilisierung normalisiert (Huber et al., 2002). Die Qualität aller Datensätze wurde durch Dichteplot, RNA Degradation Plot und Korrespondenzanalyse getestet. Eine statistische Analyse zur Selektion unterschiedlich exprimierter Gene wurde unter Verwendung des LIMMA (Linear Models for Microarray Analysis) -Pakets durchgeführt (Smyth et al., 2003). Kurz gesagt wurde die Gesamt-RNA unter Verwendung des iScriptTM-cDNA-Synthesekits (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA, 170 für qPCR, das iCycler iQ-System (BioRad Co., Hercules, CA, USA) mit QuantitFast SYBR Green PCR Master Mix (QuantiFast SYBR Green PCR Kit, Qiagen GmbH) wurde die PCR in Duplikaten für jede Probe durchgeführt. Die amplifizierten Transkripte wurden mit Hilfe des vergleichenden CT-Verfahrens, analysiert mit dem BioRad iCycler iQ Systemprogramm, quantifiziert.

BDNF-ProteinkonzentrationDas Putamen wurde gestört und in TEVP, pH 7,4, homogenisiert. (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) und dem TissueLyser-System (QIAGEN Inc.) unter Verwendung von 5 Perlen aus rostfreiem Stahl (10 Tris-HCl, 5 NaF, 1 Na 3 VO 4, 1 EDTA, Die Homogenisierung erfolgte bei 20 ° C für 2 Homogenate wurden bei 32 ° C für 16 bei 4 zentrifugiert, um cytosolische Fraktionen zu erhalten. Der Proteingehalt wurde durch das Bradford-Verfahren unter Verwendung des Biorad-Protein-Tests (BioRad Co.) und Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Die Platten wurden in einem Tecan Spectra Mini ELISA-Leser (Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Deutschland) bei 405 gelesen und die Daten wurden von der Synelisa-Software (Pharmacia Upjohn Diagnostics Sverige AB, Uppsala, Schweden) analysiert.

Die Messung von Dopamin-, DOPAC- und HVABrain-Geweben (Putamen) wurde mit HPLC mit elektrochemischem Nachweis wie oben beschrieben hergestellt und analysiert (Scheller et al., 2005). Kurz gesagt wurden Hirngewebe in 150 Phosphorsäure (Merck, Darmstadt, Deutschland), ergänzt mit 500 Diethylentriaminpentaessigsäure, mittels eines Ultraschallgerätes (Branson W 250, Wirkungsgrad 50 40 Impulse) in einer Argonatmosphäre auf Eis unterbrochen. Die Homogenate wurden bei 44 ° C zentrifugiert (Sorvall, Deutschland), die Überstände wurden durch Molekulargewichtsfilter (Cutoff 5 Millipore, Bedford, USA) bei 4 abgetrennt, um hochmolekulare Verbindungen zu entfernen, indem man mit einer MicroRapid-Zentrifuge (Hettich, Tuettlingen, Deutschland) und bis zur Analyse gelagert. Filtrate von 20 wurden in einen Rheodyne-Injektor (Typ 7725, Eppelheim, Deutschland) injiziert und auf Dopamin, HVA und DOPAC durch Umkehrphasen-HPLC mit elektrochemischem Nachweis analysiert. Die HPLC bestand aus einer Lösungsmittelförderpumpe (P580, Dionex, Deutschland), einem elektrochemischen Detektor (EC3000,cartier gold armband replika, Rezept, Deutschland) mit einer glasigen Kohlenstoffelektrode. Louis, USA), 0,65 1 Octansulfonsäure und 0,5 Triethylamin. Qualitative und quantitative Analysen wurden durch Vergleich von Retentionszeiten und Peakhöhen mit denen von handelsüblichen Standards (Sigma) durchgeführt.

Histopathologie und Immunhistochemie Für die routinemäßige Histologie wurden Paraffin-eingebettete Schnitte (4 mit H Luxol schnellblau und Masson-Trichrom gefärbt. Um die aktivierte Mikroglia zu identifizieren, wurde ein Antikörper gegen das HLA-Klasse-II-Antigen (Klon CR3 DAKO diagnostica, Hamburg, Deutschland) verwendet Die Sektionen wurden mit einem BX 50 Olympus-Mikroskop betrachtet und die Bilder wurden von einer CCD-Kamera gesammelt.

Plasma-Virus-LoadViral-RNA im Plasma wurde durch eine quantitative kompetitive RNA bestimmt, wie wir zuvor beschrieben haben (Scheller et al., 2005). Für die Zielsequenz wurde eine hochkonservierte 267 bp-Region im SIV-gag-Gen ausgewählt, wobei Primer- und Sondenregionen für SIVmac, SIVsm und chimäre SHIV-Viren homolog waren (Ten Haaft et al., 1998). Die Nachweisgrenze dieses Tests betrug 40 RNA-Äquivalente pro Milliliter Plasma.

Statistische AnalyseDer Mann-U-Test wurde für die statistische Analyse verwendet. Zur Korrelation wurde der Spearman r bestimmt. Infizierte Tiere klinisch asymptomatisch mit nur einer generalisierten Lymphadenopathie. SIV-infizierte Tiere wurden infiziert und zeigten eine Abnahme der CD4-T-Zellzahlen im Blut (Tabelle 1). SIV-infizierte Tiere zeigten einen für langsame Progressoren typischen Krankheitsverlauf, der durch eine mäßige Viruslast und Konservierung von CD4-T-Zellen charakterisiert war (Tabelle 1). Sie wurden zu vorgegebenen Zeitpunkten gemäß dem experimentellen Zeitplan ohne AIDS-definierende Bedingungen getötet. Die intrathekalen viralen Antigenspiegel in diesen asymptomatischen Tieren lagen unter der Nachweisgrenze des Assays (Daten nicht gezeigt). Metabolitenveränderungen waren mit unseren früheren Befunden mit einem größeren Satz von Tieren vergleichbar (Scheller et al., 2005). Jedoch erreichten diese Veränderungen in der vorliegenden Arbeit aufgrund der geringen Anzahl nicht infizierter Tiere und der relativ hohen Variation der SIV-Gruppe keine signifikante Bedeutung (Abbildung 1). Memantin-Behandlung verhindert Dopamin-Defizite in Putamen von SIV-infizierten Affen (Abbildung 1a) ohne statistisch signifikante Veränderungen an den Metaboliten. Allerdings zeigte sich ein starker Trend bei einem erhöhten Dopaminumsatz während einer SIV-Infektion, die durch Memantin umgekehrt wurde (Abbildung 1b). Die große Variation des Dopaminumsatzes zwischen Tieren in der SIV-Gruppe erlaubte keinen statistisch signifikanten Unterschied Dopamin (a), DOPAC (D) und HVA (e) sind Verhältnisse zwischen Metaboliten und Dopamin und stellen Dopaminumwandlung dar. Uninfizierte, nicht infizierte (n SIV, SIV-infizierte (n SIV.) Und HVA (c) -Konzentrationen im Putamen von Rhesusaffen SIV-infiziert (n Daten repräsentieren signifikant verschieden von nicht infizierten Affen, signifikant verschieden von SIV-infizierten Affen (Mann-U-Test für nichtparametrisch verteilte Werte).

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Zusammen mit der Dopamin-Beeinträchtigung wurden die BDNF-Genexpression und die Proteinkonzentrationen bei SIV-infizierten Tieren im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen verringert (2). Memantine stark erhöhte BDNF-Konzentrationen (Abbildung 2). Der BDNF-Proteinanstieg beruhte auf einer Hochregulation der BDNF-mRNA, bestimmt durch Gen-Chip-Arrays und Echtzeit-RT (2a und b). Eine starke Korrelation zeigte sich zwischen dem Dopamingehalt und der BDNF-Expression, was zeigt, dass die Expression von BDNF direkt mit Dopamin-Konzentrationen in Putamen in unbehandelten Tieren assoziiert ist (2d). Darüber hinaus waren BDNF-Spiegel in infizierten Tieren, die mit Memantin behandelt wurden, signifikant höher als in nichtinfizierten Makaken (2b und c). (A) Das Hitzplot-Profil der Expressionsniveaus des BDNF-Gens zeigt eine signifikante Veränderung der basalen Expressionsunterschiede zwischen SIV (SIV-infizierte n und SIV-infizierte n-Gruppen (Gen-Chip-Arrays), Proben von jeder Gruppe wurden gepoolt und die Spalten 1 und 4 (B) Echtzeit-RT bestätigt die Hochregulation von BDNF durch Memantin (c) BDNF-Proteinkonzentrationen in zytosolischen Fraktionen von SIV- und SIV-Gruppen Putamen von Rhesusaffen Die Daten repräsentieren signifikant verschieden von nicht infiziertem, signifikant verschiedenem von SIV (Mann-U-Test für nichtparametrisch verteilte Werte).

Memantin- und SIV-Gehirn-PathologieDie gelegentlichen perivaskulären Manschetten, als Anzeichen einer Entzündung während der frühen Infektion, wurden in Hirnregionen bei SIV-infizierten asymptomatischen Tieren nachgewiesen. Pathologische Merkmale der späten Phase der Infektion waren nicht evident. Die Behandlung mit Memantin wirkte sich weder positiv noch negativ auf diese wenigen frühen Anzeichen einer SIV-Pathologie aus. Die Routine Histologie zeigte, dass Putamen und im Allgemeinen die Basalganglien unauffällig blieb (Abbildung 3a und b). Asymptomatische SIV-infizierte Tiere zeigten wenige aktivierte Mikroglia meist in der Nähe von Blutgefäßen (Abbildung 3c). Die Behandlung mit Memantin beeinflusste die MHCII-Expression an Protein (Abbildung 3d) oder Gen-Levels (Daten nicht gezeigt). Hämatoxylin und Eosin (oben), HLA-Klasse II (Klon-CR3-Immunhistochemie) (a) Keine SIV-spezifische Pathologie ist an der Routinehistologie von SIV-infiziertem asymptomatischem Tier offensichtlich, (b) Die Behandlung mit Memantin verändert nicht das histologische Erscheinungsbild von SIV (C) Wenig aktivierte CR3-Mikroglia in der Nähe eines Blutgefßes in SIV-infiziertem asymptomatischem Tier, (d) Die Behandlung mit Memantin hat keine Wirkung auf die Aktivierung von Mikroglia in SIV-infiziertem Tier.

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By LLLOO6
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